養(yǎng)細(xì)胞這件事兒，看似簡單，然而卻常常因?yàn)楦鞣N原因，讓我們珍貴的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞一再受損或者死亡，今天為大家講述細(xì)胞從復(fù)蘇、傳代到凍存等一系列過程及常遇到的那些你可能忽略的小卻重要的細(xì)節(jié)。

一、細(xì)胞的營養(yǎng)來源

針對大多數(shù)腫瘤細(xì)胞，營養(yǎng)配方一般為：90%合成培養(yǎng)基(DMEM、RPMI1640、MEM等)和10%胎牛血清(FBS)；為了防止污染，可以加1%雙抗！

不同細(xì)胞的培養(yǎng)基是不同的。一般ATCC購買的細(xì)胞，針對不同細(xì)胞株，會有詳細(xì)介紹，包括生長的狀態(tài)圖、培養(yǎng)基的類型等。培養(yǎng)基一般都是偏紅色，因?yàn)榕囵B(yǎng)基加了酚紅來顯示顏色，指示pH范圍為6-8，顏色會由黃變?yōu)樽霞t。這是為了我們能更直觀觀察培養(yǎng)液的變化，如變黃，則代表偏酸，偏堿性了就顯示偏紫色。一般來說，細(xì)胞吸收營養(yǎng)后，變黃后就暗示我們要換培養(yǎng)基啦！若是細(xì)胞生長緩慢或者實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需求，是可以增加血清比例的，一般10%-20%的血清比例是比較OK的，也不建議太高的血清比例。

二、細(xì)胞的居住環(huán)境

舒適無菌的環(huán)境是細(xì)胞健康生活的重要基礎(chǔ)。細(xì)胞居住在培養(yǎng)細(xì)胞的器皿，包括形狀、規(guī)格、用途多樣的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板中。最終住進(jìn)37℃，5%CO₂的恒溫培養(yǎng)箱。

根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)的目的和用途，可以選擇不同規(guī)格的培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿，如后期要進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，一般使用 6 孔的細(xì)胞培養(yǎng)板來培養(yǎng)細(xì)胞，如果濕要進(jìn)行爬片處理，建議使用 24 孔的細(xì)胞培養(yǎng)板，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)來檢測細(xì)胞活力的話，一般用 96 孔板來種植細(xì)胞等，如果后期實(shí)驗(yàn)需求細(xì)胞量大，可以使用大的培養(yǎng)瓶，甚至細(xì)胞培養(yǎng)工廠來進(jìn)行。就細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)來說，培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿沒有太大區(qū)別，主要在于安全系數(shù)(培養(yǎng)瓶>培養(yǎng)皿)、培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量(大培養(yǎng)瓶>培養(yǎng)皿)。但是培養(yǎng)瓶成本也會相對較高，因此無特殊要求，一般選擇培養(yǎng)皿即可。

三、細(xì)胞的復(fù)蘇與凍存(原則是慢凍速融)

1. 細(xì)胞復(fù)蘇：指將凍存的細(xì)胞解凍之后重新培養(yǎng)，細(xì)胞恢復(fù)生長的過程。

復(fù)蘇過程如下圖所示：

有時候會出現(xiàn)細(xì)胞復(fù)蘇后，難以貼壁的情況，這個時候主要考慮細(xì)胞凍存時狀態(tài)差或者復(fù)蘇時動作太慢導(dǎo)致細(xì)胞死亡。切記最重要的融化速度要快，可不時搖動冷凍管，使之盡快通過最易受損的溫度段(-5～0℃)。還有一種情況就是細(xì)胞貼壁了，卻長不起來，這是因?yàn)橐恍┘?xì)胞傾向于維持一定的密度，可將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到較小的培養(yǎng)瓶或皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

2. 細(xì)胞凍存 將細(xì)胞放在低溫環(huán)境(-70℃~-196℃)，細(xì)胞內(nèi)的代謝降低，可最大限度的保存細(xì)胞活力，以便長期儲存。

目前細(xì)胞凍存多采用DMSO二甲基亞砜或甘油作保護(hù)劑，細(xì)胞凍存液的配方有很多種，如培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高濃度血清有助于維護(hù)細(xì)胞活力，復(fù)蘇存活率在80%～90%以上。大部分實(shí)驗(yàn)室用細(xì)胞凍存盒來進(jìn)行細(xì)胞凍存，如果沒有細(xì)胞凍存盒，可先將凍存管放入4℃冰箱中10min，再移至-20℃冰箱30min，-80℃冰箱2h或過夜，最后放入液氮罐內(nèi)。為了節(jié)約時間，還可直接在凍存盒外包裹一團(tuán)棉花，用棉花代替凍存盒緩慢降溫的特點(diǎn)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱過夜，再轉(zhuǎn)移至液氮保存。為了保證細(xì)胞復(fù)蘇后的細(xì)胞數(shù)量，一般在凍存細(xì)胞時每管細(xì)胞的濃度應(yīng)在10⁶—10⁷個/ml/管。

四、細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

細(xì)胞傳代：細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不斷增殖，培養(yǎng)皿/瓶空間有限，當(dāng)細(xì)胞接觸過密，生長就會受到抑制，影響細(xì)胞狀態(tài)，因此我們要把其中一部分細(xì)胞分到別的培養(yǎng)皿/瓶里。

Q：為什么我們總說選擇對數(shù)期細(xì)胞傳代?

A：細(xì)胞的生長和分裂，一般遵循以下模式：停滯期，對數(shù)期(指數(shù)期)，平穩(wěn)期(平臺期)和衰退期。為了確保活力，遺傳穩(wěn)定性和表型穩(wěn)定，必須使細(xì)胞保持在對數(shù)期。

Q：那如何確定細(xì)胞對數(shù)期?

A：根據(jù)上述細(xì)胞生長曲線，為了確保活力，必須使細(xì)胞保持在對數(shù)期就傳代，所以一定不能等到細(xì)胞長滿100%融合時才去消化傳代。一般細(xì)胞長到 70% -80%左右即可傳代。

Q：一般細(xì)胞傳代都是1分2嗎?

A：要根據(jù)不同細(xì)胞生長速度以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)安排而定，沒有固定的必須1分幾，常規(guī)1分2至1分5都可以。此時我們就要多觀察摸索最合適的傳代比例。

Q：消化很關(guān)鍵嗎?

A：不得不說，細(xì)胞狀態(tài)差，很多時候與傳代時胰酶消化密切相關(guān)。一般腫瘤細(xì)胞消化1-2min即可。但是每一種細(xì)胞貼壁能力不同，因此對胰酶的反應(yīng)也不同，我們需要密切跟蹤。一般肉眼觀察到貼壁細(xì)胞層能移動即可終止;而非細(xì)胞全部分散成單個。

Q：部分比較難消化的細(xì)胞怎么辦?

A：可放于37℃培養(yǎng)箱消化。以MDA-MB-231/PAX紫杉醇耐受細(xì)胞為例，放于37℃培養(yǎng)箱消化5-8min，輕輕拍打，才見細(xì)胞成片移動，因此針對難消化細(xì)胞一定要在顯微鏡下密切觀察。

Q：幾天換培養(yǎng)基?

A：正常情況下，培養(yǎng)液偏紅色。如果細(xì)胞維持在pH6.5～6.6條件下，培養(yǎng)基變黃，說明培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物已堆積到一定量，細(xì)胞會脫落死亡，需要更換新鮮培養(yǎng)液。一般細(xì)胞生長旺盛時1～2天換一次，生長緩慢時，3～4天亦可。針對復(fù)蘇后的細(xì)胞，建議隔天換液。

Q：每天觀察細(xì)胞有必要嗎?

A：一般的腫瘤細(xì)胞我們是隔天傳代，但是切不可忽略對細(xì)胞的觀察，一定要每天都要去看一下細(xì)胞，肉眼觀察培養(yǎng)基狀況、顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。記住，是每天。

Q：如果細(xì)胞形態(tài)不清晰或有異物等，如何處理?

A：可以考慮如下操作：首先，倒掉舊的培養(yǎng)基，用新的培養(yǎng)基或者PBS洗滌2-3次，再開始正式的消化、吹打。其次，把吹打下來的細(xì)胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。后續(xù)再密切觀察。

Q：細(xì)胞污染怎么辦?

A：如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有污染，一般建議丟棄。如果細(xì)胞非常寶貴，可試著加入含抗生素的培養(yǎng)基反復(fù)清洗，并用抗生素含量高的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并經(jīng)常更換培養(yǎng)基;

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